پیشگفتار

به نام آنکه هستی را رقم زد                  نشان خویش بر لوح و قلم زد

در حال حاضرجمعیت جهان به بیش از 7 میلیارد نفر رسیده است و این رشد، حالت افزایشی به خود گرفته است. این سرعت رشد تا حدود سال 2050 ادامه خواهد یافت. سالی که بر اساس پیش‌بینی سازمان ملل، سرعت رشد جمعیت جهان تقریباً به حالت ثابت رسیده و جمعیت 1/9 میلیارد نفر را خواهد داشت. نکته قابل تأمل این است که برای رسیدن به جمعیت 2 میلیارد نفر در سال 1800، هزاران سال طول کشیده در حالی که از این بعد فقط 25 سال کافی است تا 2 میلیارد نفر به جمعیت بشری اضافه گردد. اضافه می‌نماید، انسان‌ها طولانی‌تر عمر می‌کنند و در حال مهاجرت از روستاها به شهرها هستند. علاوه بر این، مردم در حال رقابت شدید برای انرژی تجدیدپذیر، خریداری زمین برای تولید غذا و همچنین صرف هزینه برای انرژی هستند. بنابراین، تولید غذا تا سال 2050 باید دو برابر شود و یا اینکه قحطی جهانی که مالتوس 200 سال قبل پیش‌بینی کرده بود رخ می‌دهد. این چالش فراهم نمودن غذا برای دنیا، دانشمندان را هدایت می‌کند به سویی که سیستم تولید بهینه غذا را معرفی نمایند. در این راستا، نوآوری‌های زیادی به کار گرفته شده است. از آن جمله می‌توان به کشاورزی دقیق، کاربرد عناصر غذایی میکرو، کشاورزی حفاظتی و مدیریت مجتمع محصول اشاره نمود. در این میان، بیوتکنولوژی به عنوان یکی از نوآوری‌های مهم به حساب می‌آید که در قرن گذشته مسئول بیش از نیمی از افزایش محصول بوده است.

کتاب پیش رو نتیجه تجربیات سال‌ها کار عملی و تدریس در حوزه بیوتکنولوژی گیاهی مؤلفین می‌باشد که در آن تلاش شده است، کلیات علم بیوتکنولوژی گیاهی به زبانی ساده و روان برای استفاده طیف گسترده‌ای از کاربران ارائه گردد.

این اثر مطابق سرفصل درس بیوتکنولوژی گیاهی مقطع کارشناسی علوم زراعی ـ باغی دانشگاه جامع علمی - کاربردی تهیه گردیده و علاوه بر آن، جهت آشنایی دانشجویان با مباحث نوین بیوتکنولوژی، بخش‌های جداگانه در خصوص اومیکس گیاهی و بیوانفورماتیک نیز آورده شده است. این بخش‌های جدید حتی می‌تواند برای دانشجویان تحصیلات تکمیلی نیز قابل استفاده باشد.

بدون شک این کتاب نمی‌تواند کامل و خالی از نقص باشد. امید است صاحب نظران و دانشجویان ما را از نظرات اصلاحی خود بی‌بهره نگذاشته، تا در بازنگری و تجدید نظر بعدی کتاب از آنها استفاده گردد.

در پایان لازم می‌دانیم از کلیه کسانی که ما را در تهیه و ارائه این اثر یاری دادند، به‌ویژه آقای دکتر حسین جعفری (عضو هیأت علمی مرکز تحقیقات و آموزش زنجان) به خاطر ویراستاری علمی و همین طور دانشجویان ارشد بیوتکنولوژی ورودی 95 دانشگاه زنجان به دلیل همکاری در تهیه بخشی از مطالب این کتاب و در انتها بخش انتشارات از جناب آقای مهندس غلامی مدیریت محترم انتشارات ساکو به خاطر هماهنگی مراحل مختلف چاپ صمیمانه سپاسگزاری نماییم.

 نگارندگان                    

  parvizmoradi@gmail.com

پیشگفتار 8

 

فصل اول: کلیات و اهداف بیوتکنولوژی گیاهی

مقدمه. 12

جمعیت جهان و غذا 13

تغییرات اقلیمی.. 13

مواد زیستی جدید. 14

تعریف بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک... 15

تاریخچه بیوتکنولوژی.. 16

اهمیت و کاربرد بیوتکنولوژی در اصلاح نباتات.. 20

آثار و فواید مورد انتظار بیوتکنولوژی.. 21

کمک به کشاورزان در داشتن زندگی بهتر. 22

تقویت محیط زیست در کشاورزی پایدار 22

منابع استفاده شده در فصل اول.. 24

 

فصل دوم: کشت بافت و سلول

مقدمه. 26

کشت بافت گیاهی و تاریخچه آن.. 26

توتی پوتنسی سلولی.. 28

نیازمندی‌های عمومی کشت بافت گیاهی.. 28

فضای فیزیکی آزمایشگاه کشت بافت.. 29

اتاق شستشو. 29

اتاق تهیه محیط کشت.. 29

اتاق استریل مواد و وسایل.. 29

اتاق کشت.. 29

اتاق نگهداری نمونه‌های کشت شده 30

گلخانه. 30

محیط کشت.. 31

اجزای تشکیل‌دهنده محیط کشت.. 31

ترکیبات آلی و غیر آلی پایه. 31

تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی.. 35

مواد جامدکننده محیط کشت.. 37

تنظیم pH محیط کشت و استریل آن.. 37

ریزنمونه. 37

انتخاب ریزنمونه. 37

استریل سطحی ریزنمونه. 38

واکشت.. 38

انواع کشت بافت.. 39

کشت کالوس... 39

کشت کالوس و جنین‌زایی سوماتیکی.. 39

نکات مهم در کشت کالوس... 41

کشت سوسپانسیونی.. 41

کاربردهای کشت سوسپانسیونی.. 42

نکات مهم در کشت سوسپانسیون.. 42

کشت پروتوپلاست.. 42

کاربردهای کشت پروتوپلاست.. 43

نکات مهم در کشت پروتوپلاست.. 44

ریزازدیادی.. 44

کشت جنین.. 45

کشت گیاهان هاپلوئید. 46

تنوع سوماکلونال.. 47

کاربردهای کشت بافت.. 47

تولید متابولیت‌های ثانویه. 47

کشت ریشه‌های مویین.. 48

تکثیر گیاهان.. 48

مهندسی ژنتیک... 49

تولید گیاهان هاپلوئید. 50

تولید گیاهان عاری از ویروس... 51

منابع استفاده شده در فصل دوم. 52

 

فصل سوم: تکنیک دی هاپلوئید در اصلاح نباتات

مقدمه. 58

تاریخچه. 58

تعریف اصطلاحات.. 59

روش‌های القای هاپلوئیدی.. 60

از طریق این‌ویوو (در شرایط طبیعی روی گیاه) 60

وقوع طبیعی پدیده هاپلوئیدی.. 60

بکرزایی یا پارتنوژنزیز. 61

حذف کروموزومی.. 63

سایر تلاقی‌های دور برای تولید دابلد هاپلوئید. 73

تولید هاپلوئید از طریق این ویترو (در شرایط آزمایشگاهی) 74

کشت بساک و دانه گرده 74

کشت تخمدان و تخمک... 77

تعیین سطوح پلوئیدی.. 78

دو برابر کردن کروموزم‌های گیاهان هاپلوئید. 79

زخمی کردن و باززایی گیاهان.. 80

القای کالوس و باززایی گیاهان مضاعف شده 80

کاربرد مواد شیمیایی.. 80

نسل مناسب برای تولید دابلد هاپلوئید. 81

مزایا و مشکلات روش‌های هاپلوئیدی.. 82

مزایای روش هاپلوئیدی.. 82

مشکلات مربوط به تولید گیاهان هاپلوئید. 83

کاربردهای هاپلوئیدها 84

کاربرد هاپلوئید دوبله شده در مقاومت به بیماری‌ها 84

کاربرد هاپلوئید دوبله شده در مقاومت به خشکی.. 85

کاربرد هاپلوئید دوبله در مقاومت به شوری.. 86

کاربرد جهش به همراه روش هاپلوئیدی.. 86

کاربرد هاپلوئیدی در تولید لاین اینبرد. 87

منابع استفاده شده فصل سوم. 89

 

فصل چهارم: اصول تکنولوژی DNA نوترکیب و کلونینگ

مقدمه. 94

مفهوم کلون‌سازی ژن.. 95

مراحل کلون‌سازی.. 96

آنزیم‌های مورد استفاده برای کلون‌سازی.. 96

جداسازی مولکول‌های اسید نوکلئیک با الکتروفورز 100

آشکارسازی و مشاهده مولکول‌های DNA... 100

تخمین اندازه مولکول‌های DNA... 101

اتصال مولکول‌های DNA به یکدیگر. 102

ترنسفورم کردن سلول باکتری.. 102

وارد کردن DNA فاژی به سلول‌های باکتریایی.. 104

شناسایی سلول‌های حاویDNA  نوترکیب (غربال کردن) 105

انتخاب براساس غیر فعال شدن القایی.. 107

غیرفعال‌سازی ژن LacZ′ 109

انتخاب فاژهای نوترکیب.. 110

منابع استفاده شده در فصل چهارم. 112

 

فصل پنجم: ناقل‌های کلون‌سازی و انواع آن

مقدمه. 114

پلاسمیدها 114

ناقل‌های کلون‌سازی بر اساس پلاسمید‌های E.coli 115

ناقل pBR322.. 115

ناقل pUC18.. 116

ناقل‌های کلون‌سازی بر مبنای باکتریوفاژها 117

باکتریوفاژها 117

چرخه لیتیک... 118

چرخه لیزوژنی.. 118

چرخه آلودگی فاژ M13.. 119

ناقل‌های فاژ M13.. 119

ناقل فاژمید. 121

ناقل‌های فاژ λ. 122

ناقل‌های الحاقی.. 122

ناقل‌های جایگزینی.. 123

کلون‌سازی با ناقل‌های الحاقی یا جایگزینی λ. 123

ناقل‌های کاسمید. 125

منابع استفاده شده فصل پنجم. 127

 

فصل ششم: واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

مقدمه. 130

اجزای واکنش PCR.. 130

DNA الگو. 131

آنزیم Taq polymerase. 131

نوکلئوتیدها 131

بافر. 132

یون منیزیم. 132

آغازگر‌ها 132

واکنش RT-PCR.. 135

کاربردهای  PCR.. 135

منابع استفاده شده فصل ششم. 137

 

فصل هفتم: آشنایی با روش‌های انتقال ژن به گیاهان

مقدمه. 140

روش‌های انتقال ژن به گیاهان.. 140

انتقال ژن با اگروباکتریوم. 140

پلاسمید Ti 141

ناقلین جایگزین.. 143

ناقلین دوگانه. 144

تولید گیاهان تراریخته با Ti پلاسمید. 145

ژن‌های گزینشگر. 146

انتقال ژن با تفنگ ژنی.. 147

گیاهان تراریخته و نقش آنها در اصلاح نباتات.. 148

گیاهان مقاوم به آفات و بیماری‌ها 148

سم دلتا اندوتوکسین.. 149

گیاهان تراریخته BT.. 149

گیاهان مقاوم به علف‌کش... 150

خاموش کردن ژن‌ها 152

اصول تکنولوژی RNA آنتی‌سنس... 152

مهندسی ژنتیک برای رسیدن گوجه‌فرنگی.. 152

بررسی گیاهان تراریخته از نظر پایداری ترنس‌ژن‌ها 154

خاموشی در مرحله رونویسی.. 155

خاموشی پس از رونویسی.. 156

منابع استفاده شده فصل هفتم. 158

 

فصل هشتم: نگرش‌های اجتماعی در مورد گیاهان تراریخته

مقدمه. 160

اثرات اقتصادی گیاهان تراریخت.. 160

نگرانی‌های زیست محیطی.. 162

منابع استفاده شده فصل هشتم. 164

 

فصل نهم: نشانگرهای مولکولی و کاربرد آنها در اصلاح نباتات

مقدمه. 166

نشانگرهای مرفولوژیکی.. 166

نشانگرهای مولکولی.. 167

نشانگرهای بیوشیمیایی.. 168

مزایا و معایب نشانگرهای بیوشیمیایی.. 168

نشانگرهای مولکولی.. 169

روش‌های غیر مبتنی بر PCR.. 169

RFLP.. 169

آنزیم‌های محدودگر. 170

کاوشگرهای مولکولی.. 170

مراحل انجام RFLP.. 171

مزایا و معایب تکنیک RFLP.. 171

روش‌های مبتنی بر PCR.. 172

تکنیک RAPD... 172

مراحل انجام تکنیک RAPD... 173

مزایا و معایب تکنیک RAPD... 173

تکنیک AFLP.. 173

مراحل انجام تکنیک AFLP.. 175

مزایا و معایب تکنیک AFLP.. 175

تکنیک SSR.. 176

مراحل انجام تکنیک SSR.. 177

مزایا و معایب تکنیک SSR.. 178

تکنیک ISSR.. 178

مراحل انجام تکنیک ISSR.. 179

مزایا و معایب تکنیک ISSR: 179

کاربرد نشانگرهای DNA در مطالعه گیاهان.. 180

منابع مورد استفاده فصل نهم. 181

 

فصل دهم: پروتئومیکس

مقدمه. 184

اهمیت پروتئومیکس... 185

اساس تجزیه و تحلیل پروتئوم. 186

مراحل انجام یک آزمایش پروتئومیکس... 186

1- تهیه نمونه مناسب.. 186

2- استخراج پروتئین.. 186

3- جداسازی مبتنی بر الکتروفورز 187

4- آشکارسازی پروتئین‌ها 190

5- آنالیز کمی پروتئین‌ها با نرم‌افزار 191

6- شناسایی پروتئین‌های موجود در پروتئوم. 192

7- انواع تغییرات مشاهده شده در مطالعه پروتئوم. 193

پروتئومیکس در علوم گیاهی.. 194

منابع استفاده شده فصل دهم. 195

 

فصل یازدهم: متابولومیکس

مقدمه. 198

استراتژی‌های مورد استفاده در متابولومیکس... 201

انگشت نگاری متابولیکی.. 201

پروفایل متابولیکی (بدون هدف) 201

تجزیه متابولایت هدف یابی شده 202

تکنیک‌ها 203

NMR (رزونانس مغناطیسی هسته) 203

طیف‌سنج جرمی (Mass spectrometry) 207

کروماتوگرافی گازی ادغام شده با طیف‌سنج جرمیGC/MS.. 208

کروماتوگرافی مایع ادغام شده با طیف سنج جرمیLC/MS.. 209

الکتروفورز مویینگی ادغام شده با طیف سنج جرمی (CE/MS) 211

تزریق مستقیم نمونه به FTICR(DI-FTICR) 211

روش‌های طیف‌سنجی نوری.. 213

طیف‌سنجی مادون قرمز IR و تبدیل فوریه مادون قرمز FTIR   214

مادون قرمز نزدیک NIR.. 216

طیف‌سنجی رامان.. 216

نتیجه‌گیری کلی.. 219

منابع استفاده شده فصل یازدهم. 221

 

فصل دوازدهم: بیوانفورماتیک

مقدمه. 226

شاخه‌های بیوانفورماتیک... 228

به کارگیری دانش بیوانفورماتیک... 229

پایگاه داده 229

مقدمه‌ای بر پایگاه داده‌ها در علوم زیستی.. 230

پایگاههای داده توالی‌های DNA... 230

معرفی GenBank.. 231

پایگاههای اطلاعاتی پروتئین.. 231

معرفی چند پایگاههای اطلاعاتی توالی‌های پروتئینی.. 232

پایگاه اطلاعات پروتئینی UniProtKB.. 232

PDB (Protein Data Bank) 232

پایگاه PROSITE.. 232

پایگاه InterPro.. 233

هم‌ردیفی و جستجوی توالی در پایگاههای اطلاعاتی.. 233

BLAST روش متداول جستجوی توالی.. 235

انواع BLAST.. 235

کاربردهای بیوانفورماتیک... 236

منابع مورد استفاده فصل دوازدهم. 237

 

فصل سیزدهم: عملیات آزمایشگاهی

برخی علائم اختصاری.. 240

پیشنهادات کلی برای کار در آزمایشگاه 240

نکات ایمنی در آزمایشگاه بیوتکنولوژی.. 241

محاسبات پایه برای تهیه محلول‌های آزمایشگاهی.. 242

غلظت بر حسب درصد وزن به حجم (%w/v) 243

غلظت بر حسب مولاریته. 243

رقیق‌سازی محلول‌ها 243

روش تهیه چند محلول رایج مورد استفاده در آزمایشگاه بیوتکنولوژی   243

روش تهیه محلول EDTA (5/0مولار، 8 pH ) 244

محلول Tris-HCl (1مولار، 8 pH ) 244

بافر (Tris-EDTA) TE.. 244

استخراج DNA از نمونه‌های گیاهی.. 245

آماده‌سازی نمونه گیاهی برای استخراج DNA... 245

مراحل استخراج DNA ژنومی به روش CTAB.. 245

استخراج DNA ژنومی باکتری.. 248

کشت باکتری.. 248

مراحل استخراج DNA ژنومی باکتری.. 249

استخراج پلاسمید (در مقدار کم) به روش لیز قلیایی.. 251

آماده‌سازی کشت باکتریایی.. 251

استخراج DNA پلاسمیدی از باکتری  E. coli 251

ارزیابی کیفی و کمی DNA استخراج شده 253

الکتروفورز ژل.. 255

بافرهای الکتروفورز 255

بافرهای بارگذاری.. 256

انواع الکتروفورز ژل.. 257

الکتروفورز ژل آگارز 257

تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز ژل افقی.. 259

الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید. 263

انواع ژل پلی‌‎اکریل‌آمید. 264

ژل ‌پلی‌اکریل‌آمید غیرواسرشت‌کننده 265

تهیه ژل ‌پلی‌اکریل‌آمید غیرواسرشت‌کننده 266

رنگ‌آمیزی ژل پلی‌اکریل‌آمید با استفاده از نیترات نقره 270

منابع استفاده شده فصل سیزدهم. 272